Samozrejme, môže to byť aj falošná múmia, pretože v časoch križiackych výprav falošné relikvie neboli ničím výnimočným. Istotne je to však múmia s najdlhšou zdokumentovanou historiou v Španielsku, takže je to unikát! Vieme o nej, že počas dlhých storočí bola niekoľkokrát premiestňovaná, vymenili jej truhličku a aj vankúšik. Bola kontaminovaná plesňami, ale našťastie sa ju reštaurátorom z “Ústavu na záchovu a obnovu kultúrneho dedičstva” v Castellone podarilo zrekonštruovať, o čom som písala v minulom blogu.
Analýza pohlavia a určenie geografického pôvodu (teda akejsi "národnosti") sa robí pomocou reakcie PCR celkom bežne (polymerázová reťazcová reakcia, podrobne o nej píšem v mojom staršom blogu). Ak vás zaujíma váš vlastný pôvod, môžete si takúto analýzu objednať aj vy za niekoľko desiatok eur v jednej z mnohých genetických firiem. Najbežnejšia metóda odberu vzorky je, že vatovou tyčinkou zoškrabete zo vnútornej strany svojich líc pár buniek a za pár dní máte výsledky. To som urobila aj ja a aj môj kolega, aby sme si pripravili pozitívne kontroly ženy a muža na náš experiment. V prípade múmie sa však DNA nachádza už vo veľmi zničených tkanivách. Dlhoročným sušením sa už určite nakrájala na kúsky, možno prakticky už žiadna neexistuje. Preto cirkev nepožiadala o analýzu tejto múmie žiadnu genetickú firmu, ktorá takéto analýzy robí rutinne, ale nás. Vedeli, že je to ťažká úloha, vyžadujúca niekoľko týždňov či mesiacov s neistým výsledkom, takže nie každému sa s tým chce hrať. Naše laboratórium nie je síce zamerané na ľudskú genetiku, ale sme experti na prácu s minimálnym množstvom DNA. Našej šéfke sa projekt zapáčil, pretože múmia je v relatívne dobrom zakonzervovanom stave, čo môže znamenať, že v nejakých jej najtajnejších zákutiach možno objavíme ukryté baktérie staré niekoľko storočí, čo by veľmi zaujímalo zase nás. Najprv však musíme pomôcť zistiť to, o čo nás katedrála vo Valencii požiadala, teda zistiť odkiaľ múmia pochádza a či je to muž alebo žena.
Teoreticky sme mali začať s tým, či je múmia ženského alebo mužského pohlavia a prestať hneď, keď zistíme, že je to dievčatko. Potom sme sa ale zamysleli - predstavte si situáciu, keď do domu vtrhnú vojaci, ktorí majú rozkaz pozabíjať všetky detičky. Určite nebudú ma čas kontrolovať, čo sa skrýva pod plienkami. Druhá vec je, že aj keď by nám vyšiel DNA test pozitívny na mužské pohlavie, neznamená to, že táto múmia je naozaj skutočný chlapec. Múmie sa totižto dotýkalo už veľa ľudí, v minulosti ju niekoľkokrát premiestňovali, takže určite múmiu kontaminovali. To všetko znamená, že rovnako dôležité sú aj testy geografického pôvodu. Moji predkovia z niekoľkých predchádzajúcich generácii sú určite len zo Strednej Európy a kolegyňa, ktorá tiež s touto múmiou pracuje, je napol Španielka a napol Haiťanka. Podľa mapy haploskupín v Európe nemáme s juhozápadnou Áziou veľa spoločného. A obidve sme ženy.
Celé to začína extrakciou DNA. V našom prípade však nemáme k dispozícii čerstvé lícne bunky, ale akýsi skamenelý kúsoček, ktorý nám z múmie zoškrabala paleontologička. Ako vyrobiť pozitívnu kontrolu? V našich vzorkách z líc sa nachádza veľa buniek a DNA je čerstvá. Nebola by to veľmi porovnateľná pozitívna kontrola k našej múmií, pretože by vyšla veľmi jednoducho, zatiaľčo "rozchodiť" vzorku múmie bude asi problém. Preto sme nechali naše lícne bunky počas troch dní vysušiť pri vysokej teplote. V pokusoch sme potom používali ako pozitívnu kontrolu aj originálne, aj vysušené lícne bunky. Ak nedostaneme ani z originálnych lícnych buniek žiaden výsledok, znamená to, že naša PCR proste nefuguje správne. Ak originálne bunky fungujú, ale vysušené nie, znamená to, že sa ešte musíme potrápiť upraviť nejaké parametetre reakcie PCR.
PCR je reakcia, pri ktorej enzým polymeráza namnoží nami vybraný úsek DNA. Tento úsek vymedzíme primerami. Primery sú sekvencie asi 20-tich nukleotidov (písmen A, T, C, G), ktoré navrhneme podľa originálnej sekvencie DNA, ktoré sa nechávajú syntetizovať vo špecializovaných “fabrikách”. Tieto primery sa v reakcii PCR nalepia na DNA v skúmavke a polymeráza začne na ňu pripájať voľné písmenka, ktoré v skúmavke tiež plávu. Takto sa milión krát namnoží sekvencia, ktorá sa nachádza medzi týmito primerami, dlhá len niekoľko stoviek písmen. Existujú chemické látky, ktoré sa po naviazaní na DNA rozožiaria pod UV svetlom. Tento náš krátky kúsok DNA namnožený polymerázou môžeme vidieť na agarózovom géle pod UV svetlom ako krátku čiarku (alebo niekoľko čiarok), zatiaľčo jednu jedinú molekulu DNA by sme na géle nikdy nevideli. Je to jednoduchý test, či nám PCR reakcia vyšla.
Tiež, samozrejme, ak sa v skúmavke od začiatku nenachádzala žiadna molekula ľudskej DNA, tak na géle neuvidíme vôbec nič. Pri práci s múmiou sa môže ešte navyše stať, že tam aj nejaká molekula DNA bola, ale bola nakrájaná na kúsky a práve ten kúsok, ktorý potrebujeme namnožiť, chýbal alebo chýbala jeho časť.
Ak sú podmienky PCR nastavené nesprávne (napríklad nesprávna teplota alebo koncentrácia chemikálií alebo chybne vyrobené primery), môže sa stať, že sa namnoží nesprávny úsek DNA. Primery sa nalepia na nesprávne miesto na molekule DNA a polymeráza hneď začne množiť sekvenciu medzi nimi. Dokonca sa môžu nalepiť aj na DNA iného organizmu, ktorý v našej skúmavke náhodou pláve. V prípade našej múmie to môžu byť napríklad plesne. Tým len chcem povedať, že svietiaca čiaročka na géle pod UV svetlom ešte neznamená, že reakcia PCR vyšla správne, ale všetko sa dá overiť sekvenovaním. Preto testy v prípade múmie trvajú tak dlho.
V prípade rutinného genetického testu, kde je buniek skúmaného jednotlivca oveľa viac než kontaminácie z laborantky alebo z akéhokoľvek mikroorganizmu, je veľmi málo pravdepodobné, že by sme viditeľne namnožili DNA, ktorá nepatrí tomuto človeku. Lenže keď pracujeme s múmiou, pri ktorej budeme vďační za každú jednu peknú molekulu DNA, sú napríklad plesne alebo kontaminácia iným človekom dosť veľkým problémom. Predstavte si, že máte v skúmavke milión molekúl DNA plesní a jednu úbohú molekulu múmie. Primery a polymeráza sa v tejto spleti molekúl možno ani nedostanú k molekule múmie a nebudú môcť začať pracovať, takže nevyjde na géle žiaden výsledok. Preto je dôležitá čistota vzoriek.
Na určenie pohlavia sme sa najprv rozhodli použiť klasický test, ktorý sa robí v genetických laboratóriách, že ak je to muž, tak sa objavia na géle pod UV svetlom dve čiarky, ak je to žena, tak len jedna. Mali by mať dĺžku asi 1000 písmen, čo sa dá odhadnúť podľa “rebríka”, ktorý nanesieme na gél tiež ako kontrolu dĺžky čiarok. V našom prvom pokuse však fungovala len pozitívna kontrola originálnych buniek z našich líc, čo môžete vidieť na géle na obrázku. Žiadne čiarky sme nevideli ani pri vysušených lícnych bunkách, ani pri múmii. Takže niečo s PCR nebolo v poriadku.
Prečítali sme veľa vedeckých článkov a došlo nám, že snaziť sa získať produkt o dĺžke 1000 nukleotidov z múmie bude asi problém. Je celkom možné, že DNA je už v takom katastrofálnom stave, že neexistuje žiaden kúsoček dlhší než 1000 písmen na našej vyvolenej sekvencii, ktorý by sa mohol namnožiť PCR. Nechali sme si nasyntetizovať nové primery, ktoré namnožia kratší úsek a skúsili to znovu.
A po dlhých týždňoch a mesiacoch - vyšlo to! Zdá se, že je to chlapec!!!
Ja viem, že možnože pracujeme s DNA niekoho, kto túto múmiu v minulosti kontaminoval. Isté však je, že dve čiarky na géle sú, takže v našej skúmavke máme mužskú DNA.
Druhý bod je zistiť pôvod tejto múmie. To bude komplikovanejšie, lebo čiarku, ktorá sa nám na géle zobrazí, bude treba osekvenovať. Podľa podobnosti sekvencií určíme, odkia múmia pochádza, o tom rozhodujú jednopísmenkové mutácie. Ak sa test pôvodu robí živému človeku z lícnych buniek, jeho vlastných buniek je veľká väčšina, takže sa čiarka (produkt PCR) môže “rovno strčiť” do sekvenátora. Pracovali by sme s namnoženou DNA len z jedného originálu (jedného človeka), takže sekvencie z iného jedinca sa nám tam nezamiešajú. Čo ak sa v našej vzorke nachádza len pár buniek z “palestínskej” múmie a ďalšie bunky sú z nejakého Španiela, ktorý kedysi v 15-stom storočí túto múmiu ukladal do novej truhličky? Signál zo sekvenátora nebude tak jednoznačný, bude ťažké ho rozlúštiť. Existujú riešenia aj na to, ale o tom vám porozprávam až niekedy nabudúce, keď budeme mať nejaké výsledky pôvodu.
