V tomto našom článku, ktorý vyšiel v Scientific Reports (nový časopis Nature Publishing Group), sa kombinujú všetky témy, ktoré som rozoberala postupne v mojich predchádzajúcich blogoch: sekvenovanie sekvenátormi novej generácie, identifikácia baktérií pomocou metódy PCR, prietoková cytometria a hlavne bioinformatika.
V našom tráviacom trakte (a aj v iných častiach tela) žije strašne veľa baktérií. Je ich vraj 10 krát viac než našich vlastných ľudských buniek, dokopy tvoria 2 kg z našej telesnej váhy! Nie všetky z nich sú nebezpečné, práve naopak, mnohé z nich nám pomáhajú. Niektoré z nich v nás len tak prebývajú a ak sa dostaneme do nejakej nerovnováhy, tak zaútočia. To všetko je riadené našim imunitným systémom. Ten tu nie je len na to, aby ničil zlé baktérie, ale aj na to, aby rozoznával tie prospešné a nechal ich v pohode pracovať.
Podľa našich predchádzajúcich zistení nie všetky z tých 2 kg baktérií sú aktívne. Aj v tomto novom článku potvrdzujeme, že ak odstránime tie neaktívne baktérie, odhalíme, že tie aktívne sú omnoho rôznorodejšie ako tie neaktívne. Ak sa na zloženie baktérií v hrubom čreve pozrieme len tak všeobecne, vyjde nám, že najpočetnejší sú zastupcovia kmeňov Firmicutes a Bacteroidetes. Veľká časť baktérií patriacich k týmto dvom kmeňom v skutočnosti ale nie je vôbec aktívna.
Aktivitu baktérií vo vzorku výkalu určujeme podľa obsahu RNA. Čím je baktéria aktívnejšia, má viac RNA v bunke, čo znamená, že rastie a množí sa a vykonáva svoje metabolické funkcie. Takáto aktívna baktéria bude mať aj vysokú fluorescenciu, pretože baktérie vo vzorku nafarbíme fluorescenčným farbivom, ktoré sa viaže na RNA. Ak vezmeme na analýzu výkal a neaktívne baktérie v ňom odstránime pomocou prietokovej cytometrie, odhalíme, že celú prácu vykonáva v skutočnosti množstvo rozličných malých bakteriálnych kmeňov. Prietokový cytometer dokáže vytriediť tisíce baktérií za sekundu - rozdeliť ich do dvoch oddelených túb, kde v jednej budú aktívne a v druhej neaktívne baktérie.
Ako som už spomenula, ide o dosť kontroverznú tému, ktorú mnohí vedci neradi rozoberajú. Skoro všetci totiž pracujú rovno s baktériami z výkalov, bez triedenia na aktívne a neaktívne. Preto nie sú schopní odhaliť menšie kmene, ktorú sú vlastne také robotnice zodpovedné za všetko. Bez triedenia na aktívne a neaktívne sa skutočnosti len porovnáva obsah Firmicutes a Bacteroidetes. A výsledky potom vyzerajú napríklad takto: pri výskume choroby XYZ sa dospelo k záveru, že pacienti majú výššie percento Firmicutes a zdraví jedinci majú vyšší obsah Bacteroides. Z toho sa vytvorí záver, že Firmicutes sú zodpovedné za danú chorobu XYZ. V skutočnosti by však za danú chorobu mohli byť zodpovedné práve tie málopočetné rôznorodé kmene - alebo naopak: pred danou chorobou by mohli chrániť tieto málopočetné rôznorodé kmene. Ak však nepracujete s prietokovou cytometriou, tieto kmene nikdy neodhalíte. Preto nám publikovanie tohoto najnovšieho článku trvalo asi dva roky. Laboratórnu časť som robila niekedy na začiatku roku 2011 a až teraz, na konci decembra 2013, nám vyšiel článok.
Podobný prístup sme zvolili pri štúdiu toho, ktoré baktérie sú rozoznávané ľudským imunitným systémom, konkrétne sliznicovým imunoglobulínom A (IgA). V našej práci sme využili to, že biotechnologické firmy predávajú jednu chemickú zlúčeninu, ktorá sa fluorescentne rozžiari, keď sa naviaže na IgA. Vedci ich zvyčajne využívajú na iné pokusy, ale my sme sa rozhodli použiť ich na triedenie baktérií podľa fluorescencie. Baktéria, ktorá bude v našich pokusoch svietiť, má na svojom povrchu nalepené množstvo IgA, takže keď do vzorku pridáme svietiaci anti-IgA, tak aj celá baktéria bude svietiť a prietokový cytometer ju bude vedieť oddeliť od nesvietiacich. Veľmi zjednodušene je to na hornom obrázku.
Tieto baktérie oddelené do skupín sme identifikovali pomocou metódy PCR. Každý druh baktérie má totiž niečo ako svoj identifikačný preukaz, vďaka ktorému ju vieme identifikovať aj bez toho, že by sme ju museli pestovať alebo sledovať pod mikroskopom. Tento identifikačný preukaz je vlastne gén, ktorý sa volá 16S. Na internete existuje obrovská databáza sekvencií tohoto génu pre všetky známe druhy baktérií. Porovnaním dokážeme identifikovať, aké druhy baktérií v našom vzorku máme. Ak náhodou naša vzorka obsahuje nejakú baktériu, ktorú predtým ešte nikto nikdy nepestoval, tak nám táto databáza podľa sekvencie aspoň pomôže približne určiť, do ktorej skupiny (kmeňa, triedy) baktérií by mohla patriť.
Metóda PCR nám z DNA vyizolovanej z celej vzorky baktérií vytiahne vlastne len tento krátky úsek DNA - gén 16S. Na určenie zloženia druhov vo vzorku nás vlastne celé genómy všetkých baktérií veľmi nezaujímajú, pretože obsahujú množstvo podobných úsekov, napríklad pre metabolismus. Praktickejšie je pracovať len s týmto krátkym úsekom génu 16S, ktorý slúži na identifikáciu. Z jedného vzorku výkalu dostaneme niekoľko desiatok tisíc sekvencií tohoto génu. Všetky vzorky sa musia medzi sebou porovnať: teda porovnávajú sa všetci skúmaní jednotlivci a aj jednotlivé oddelené skupiny baktérií. Potom z toho vzniknú rôzne grafy, ktorých máme v článku neúrekom. Zo súboru spomínaných málopočetných rôznorodných kmeňov sme napríklad dokázali identifikovať tie kmene, ktoré boli prítomné vo výkaloch všetkých dobrovoľníkoch.
Toto bola vlastne taká pilotná štúdia, kolegovia teraz dokončili podobný výskum so zubnými baktériami a tiež aj s baktériami z materského mlieka. Okrem toho skúmame aj vzorky od pacientov s gastrointestinálnymi chorobami. To už bude oveľa zaujímavejšie.
