Po dlhšej odmlke vám teda na začiatok zreferujem, ako sa nám počas minulých mesiacov darilo so sekvenovaním na našom MinIONe. Je to malilinký sekvenátor, ktorý sa zmestí do dlane. Dá sa kúpiť za 1000 eur. Je ale len v takej testovacej fáze. Výrobcovia nám poslali skúšobnú DNA a my sme im mali odoslať naše výsledky. Bola to DNA vyextrahovaná z bakteriofága phi X 174. Je to taký základný vírus, ktorý sa často používa ako skúšobná DNA na sekvenovanie alebo ako pozitívna kontrola. Jeho genóm osekvenoval už Fred Sanger v roku 1977, čím sa phi X 174 stal prvým osekvenovaným genómom vôbec. phi X 174 nie je pre ľudí nebezpečný, lebo sa rozmnožuje v baktériách. Dá pestovať v laboratóriu napríklad tak, že necháme, aby napadol kultúru bezpečnej baktérie E. coli.
Takže dostali sme už vyextrahovanú DNA, zmiešali sme ju s ďalšími chemikáliami, aby sme ju mohli naniesť do MinIONu a spustili to. MinION má oproti veľkým sekvenátorom zaujímavú výhodu, že sekvencie spracováva v reálnom čase. Jeden run (beh prístroja) môže trvať až 24 hodín. Keď ale po prvých minútach zistíte, že vám nevychádza to, čo ste očakávali alebo že pár prvých sekvencií vám stačí na to, aby ste určili, čo vzorka obsahuje, tak môžete sekvenovanie zastaviť, chip prečistiť a dať tam novú vzorku.
Keď to porovnám so sekvenátorom Illumina (ktorý je teraz jeden z takých tých najmodernejších), tak tomu trvá jeden sekvenačný run skoro 3 dni, ďalšie hodiny sa sekvencie z neho sťahujú do počítača, kde sa ešte niekoľko ďalších hodín filtrujú podľa kvality a dĺžky. Potom podľa toho, o aký sekvenačný projekt ide, nasleduje analýza sekvencií, na čo sa môžu použiť rôzne bioinformatické metódy. Povedzme, že len chceme tak zbežne vedieť, aké rôzne baktérie sa nachádzajú v našej vzorke (napríklad ľudského výkalu). Platforma Illumina MiSeq vyprodukuje napríklad 25 000 000 sekvencií počas troch dní. Na mnohé výskumné aplikácie je to až príliš veľa. Preto existuje možnosť zmiesať vzorky do jednej sekvenačnej dostičky. Ku DNA každej vzorky prilepíme sekvenačné adaptory s charakteristickou kombináciou 8 nukleotidov. To nám potom umožní v počítači roztriediť sekvencie pochádzajúce z 96 vzoriek (384 vzoriek v novej verzii), ktoré boli vlastne zmiešané na jednej sekvenačnej dostičke. Ak použijeme kombinácie nukleotidov pre 96 vzoriek, tak z jednej dostaneme okolo 250 000 sekvencií. To je nakoniec na určenie zloženia baktérií v jednej vzorke ešte stále vlastne priveľa. Ešte pred pár rokmi sme dostávali na našom staršom sekvenátore 454 FLX+ od firmy Roche len niekoľko desiatok tisíc sekvencií a výsledky zloženia baktérií boli zhruba tie isté. Pred veľa rokmi sa používala ešte namáhavá Sangerova metóda, získavalo sa len niekoľko stoviek sekvencí a výsledky boli tiež veľmi podobné. Týmto porovnaním len chcem poukázať na to, že niekedy naozaj stačí málo sekvencií na to, aby sme zistili, či je daná vzorka zaujímavá alebo nie. Samozrejme, ak ide o sekvenačné projekty, kde sa plánuje osekvenovať celý genóm nejakého organizmu, tak to je iná vec – tam treba čo najviac sekvencií, takže robustnosť je na mieste.
Ako teda dopadol prvý sekvenačný run na MinIONe v našom laboratóriu? Dostali sme síce niekoľko tisíc sekvencií, ale mali nevyhovujúcu kvalitu – filtrom prešlo len nejakých 50 sekvencií. Tie sa porovnali s databázou všetkých doposiaľ osekvenovanćyh genómov a len pár z nich naozaj malo zhodu s bakteriofágom phi X 174. Okrem toho bolo vidieť, že sú tam početné chyby, MinION sa pomýlil v niektorých nukleotidoch. Ostatné sekvencie, ktoré prešli filtrom, nemali vôbec žiadnu zhodu s databázou. Čo to znamená? Kontaminácia nejakým neznámym, doposiaľ neosekvenovaným organizmom? Kedže išlo o čistú kultúru phi X 174, tak kontamináciu s veľkou pravdepodobnosťou vylučujem a myslím si, že to boli skôr strašne vážne sekvenačné chyby.
Čo z toho vyplýva? MinION môže byť super sekvenátor, ak potrebujeme narýchlo zistiť, či sa nejaký predominantný organizmus vo vašej vzorke naozaj nachádza. V našom prípade sme potvrdili prítomnosť fága phi X174, aj keď sme dostali veľa nepoužiteľných sekvencií. Nedávno písali v Nature o tom, ako si MinIONy brali výskumníci do pralesa, aby testovali, či sa vo vzorkách nachádza vírus eboly. Výsledok – pozitívny/negatívny – na detekciu stačí pár pozitívnych sekvencií, a to nemusia byť ani veľmi kvalitné - 100 percentná zhoda s genómami v databázach ani nemusí byť, lebo nejaký ten chybný nukleotid zhode s ebolou nezabráni. Ak ho chceli použiť na detekciu mutácií eboly v zozbieraných vzorkách, tak veľmi neverím, že sa im podarilo detekovať jedno-nukleotidové zmeny, kedže je to dosť nepresný prístroj. Ale jedno je isté: s MinIONom sa dá sekvenovať DNA vlastne aj v krajinách, kde by si veľký sekvenátor nemohli dovoliť. Strčíte MinION do príručnej batožiny a sekvenuje, kde len chcete. A tiež, bolo by napríklad super, keby sme sa v budúcnosti pri návšteve lekára za pár minút dozvedeli, aká baktéria sa to nachádza v našich hlienoch, ktoré vykašliavame. Hneď by sa vedelo, aký typ antibiotík treba nasadiť a ľudský organizmus by sa zbytočne nezaťažoval nesprávnymi liekmi.
Môj názor je, že na rýchlu diagnostiku je MinION výborný, ale keďže robí ešte stále veľa chýb, tak sa nedá veľmi použiť na rozšifrovanie vzoriek, ktoré obsahujú veľa rôznych druhov baktérií, napríklad ako ľudské výkaly. Na určenie zloženia takýchto vzoriek používame sekvenovanie ribozomálneho génu 16S. Ten je vysoko zakonzervovaný medzi baktérialnými druhmi, a preto niekedy len pár nukleotidov rozhoduje o tom, či bude daná sekvencia patriť napríklad druhu Clostridium alebo Ruminococcus. Keby sa MinION pomýlil, nebudeme nikdy presne vedieť, akému druhu sekvencia vlastne patrila. Práve som sa ale dočítala, že náš bývalý kolega, ktorý teraz pracuje v inom laboratóriu vo Valencii, skúšal sekvenovať gén 16S vzorky baktérií s vopred známym zložením. A celkom sa mu to aj podarilo, aj keď pripúšťa, že len 65-70% nukleotidov bolo osekvenovaných správne.
Ďalšou na prvý pohľad nemožnou aplikáciou pri tak vysokej chybovosti je sekvenovanie génov, ktoré sú zodpovedné za nejakú chorobu, ak sa v nich nachádza mutácia jedného nukleotidu (single nucleotide polymorphism - SNP). To by sa možno dalo vyriesiť tak, že by sa nechali osekvenovať tisícky kópií tohto génu (namnožené reakciou PCR) a z výsledku by sa vybral nejaký konsenzus. Neviem... ale mnoho ľudí hlási pozitívne výsledky s MinIONom v rôznych aplikáciách... Takže treba sa tým pohrať a výsledky môžu byť veľmi zaujímavé. Pre mňa osobne je najzaujímavejšie to, že sa nemusíte trápiť s počatočnou koncentráciou vzorky, lebo teoreticky by sa dali osekvenovať aj vzorky, v ktorých sa nachádza len pár fragmentov DNA rozpustených vo vode. To by umožnilo získať aspoň aké-také útržky sekvencií baktérií z extrémnych miest, ktoré sa nedajú kultivovať v laboratóriu. Stačila by jedna jediná bakteriálna bunka. Preto sa musíme snažiť, aby sme zlepšili výkonnosť nášho MinIONu a dostávali aspon vyšší počet sekvencií, ktoré prejdú filtrom kvality.
V NASA sa dokonca začali pohrávať s myšlienkou, že by ho vzali do kozmu. To je jasné, tam by sa veľký Illumina MiSeq alebo 454 FLX+ proste nevošli a príprava vzoriek na týchto platformách je tak zložitá, že by to v stave beztiaže proste nešlo. Na tomto odkaze si pozrite videá, ako vedci skúšali pipetovanie v stave beztiaže. Je to celkom sranda.
