Princíp majú všetky videá o extrakcii DNA rovnaký. Najprv rozpučiť ovocie až na jemnú šťavičku, pridá sa k tomu saponát, potom treba jemne prilievať alkohol a pozorovať, ako sa vám v alkoholovej časti začne objavovať nejaká akoby biela medúza. Princíp je to správny. Ide o to, aby sme otvorili bunkové steny nášho ovocia, rozbili bunkové jadro, prípadne soľou podporili zhlukovanie DNA a pomocou alkoholu nechali DNA vyplávať na povrch, pretože sa v alkohole nerozpúšťa. V niektorých videách používajú horúcu vodu, inde studenú vodu, niekde pridávajú soľ, inde nie, ale pridávajú nejaké podivné potravinárske enzýmy či gél na pranie. Po pridaní alkoholu im tam plávu všelijaké biele veci. Výsledok je v každom videu trochu odlišný, tak ani neviem, čo by som vlastne mala správne očakávať. Len v máloktorých videách končí pokus jasnou bielou medúzou, ktorú môžem pozorovať pri extrakcii v laboratóriu. Jeden pekný výsledok nájdete na tejto stránke , odkiaľ som obrázok naľavo prebrala.
Všetky videá majú jednu spoločnú vec, vždycky končia šťastným koncom, kde "kuchár" vykrikuje: "Oh
my God, oh my God, this is DNA!" Ja mám ale pochybnosti. Odkiaľ berú tí "kuchári" istotu, že to, čo im tam pláva, je naozaj DNA?
Keďže mám v mojom laboratóriu možnosť overiť si, ako môj pokus nakoniec dopadne, rozhodla som sa urobiť akýsi prienik všetkých videí, ktoré som videla, a pozrieť sa na výsledok v práci. Sama som si ale pripadala ako v kuchárskom programe Jiřího Babicu (neviem, či to sledujete aj na Slovensku, ale moji českí kamaráti sa na tom dobre bavia). Pre tých, čo Babicu nepoznajú, som tu pridala obrázok sushi, ktorý presne vyjadruje jeho štýl varenia: "Když nemáte lososa, tak tam dejte párek a když nemáte rýži, tak tam dejte kolínka!" Proste vzala som, čo som mala po ruke a pustila sa do varenia DNA.
Začala som s banánom, základ bol viac menej podľa tejto stránky. Rozmixovala som ho, až z neho vznikla taká banánová štavička. To sa robí preto, aby sa bunky oddelili a chemikálie, ktoré potom použijeme, na nich lepšie pôsobili. Pridala som lyžičku soli (aj keď sa v tomto recepte nespomína, ale používa sa vo väčšine iných receptov) a pridala som teplú vodu a zase rozmixovala. Pridala som dve lyžice saponátu na umývanie riadu a jemne premiešala, aby to nevytvorilo až tak veľa bubliniek. To by malo účinkovať tak, že sa rozložia bunkové steny a bunkové membrány. DNA sa vďaka soli začne zhlukovať a keď tam pridáme po stene hrnčeka ľadovovychladený alkohol (96-percentný), tak by sa DNA mala z tejto čalamády uvoľniť a začať plávať v alkohole ako biela medúza, pretože je v alkohole nerozpustná. Ako vidíte na obrázku, vytvorili sa tam bublinky a začalo tam niečo plávať, ale pripomínalo mi to viac nejaké nerozmixované pozostatky banánu než DNA. Vzala som vatovú tyčinku, namotala na ňu, čo v alkoholovej časti plávalo a premiestnila do malej tuby, kde som mala pripravenú kvapku vody (DNA je vo vode rozpustná).
Na druhý deň v práci som mala v pláne pustiť na elektroforéze nejaké moje naozajstné vzorky z laboratória, tak si som si povedala, že tam pridám aj moje kuchyňské dielo z predchádzajúceho večera.
Popíšem vám, ako funguje tá elektroforéza. Najprv si pripravíme gel, kde rozpustíme špeciálnu agarózu v pufre, ktorý je tvorený napríklad veľmi nariedenou kyselinou boritou a ďalšími látkami. Udržuje stabilné pH a čo je najdôležitejšie, je vodivý v elektickom poli, ktoré ním necháme prechádzať. Takže tento gél nalejeme do formičky, aby nám vzniklo niečo ako malá tabuľka čokolády o výške maximálne 1 cm. Okrem toho do tejto formičky na jeden koniec umiestnime aj akýsi hrebeň so širokými zubami, ktorý vytvorí v tomto géle dierky. Formu necháme vychladiť a hrebeň vytiahneme, takže dierky máme hotové. Tento stuhnutý gél umiestnime do elektoforéznej vaničky, ktorá má na jednom konci záporný a na druhom konci kladný pól a je napojená na zdroj elektrického prúdu. Pozor ale: DNA je nabitá negatívne, takže musíme gél do vaničky umiestniť tak, že dierky, kam budeme DNA nanášať, musia byť pri negatívnom póle vaničky. Celý princíp je založený na tom, že DNA bude cez gel priťahovaná k pozitívnemu pólu vaničky, pretože je sama od prírody nabitá negatívne. Gel vo vaničke zalejeme tým istým elektický vodivým pufrom, ktorý obsahuje gél.
Naše vzorky DNA zmiešame s takzvaným loading buffrom a pipetou ich nanesieme jednu vedľa druhej do dierok v géle. Loading buffer je chemická látka, ktorá je ťažšia ako voda, takže pomáha DNA usadiť sa na spodku dierky v géle. Určite by sa nám nepodarilo naniesť DNA len tak bez loading buffru presne do tejto dieročky, pretože by nám z dierky unikla do pufru vo vaničke. Okrem toho je loading buffer zafarbený zvyčajne na modro alebo zeleno a tiež je negatívne nabitý, takže sa v géle posúva tým istým smerom a podobnou rýchlosťou ako naša DNA. Takto dokážeme odhadnúť, kde v géle sa naša DNA nachádza. Na konci to bude vyzerať ako na vedľajšom obrázku. Keby sme nechali elektroforézu príliš dlho a nevideli sme, kde sa vzorka nachádza, mohlo by sa nám stať, že DNA sa presunie až na koniec celého gélu a potom unikne až do pufru na druhom konci vaničky, takže tak by sa nám takto stratila. Povedzme, že ak zdroj prúdu nastavíme na 120V a gel je dlhý napríklad 10 cm a hrubý 0.5 cm, tak môžeme elektroforézu nechať bežať tak pol hodinu a určite sa nestane, že by nám DNA unikla z gélu až do pufru na druhom konci. Čas závisí, samozrejme, na elektrickom prúde, ktorý do nej pustíme, ale tiež aj na hrúbke gélu. Okrem toho všetko veľmi ovplyvňuje aj koľko agarózy dáme do gélu. Ak je DNA polámaná na kúsky, tak sa v géle budú posúvať rôznou rýchlosťou. Dlhšie kúsky migrujú pomalšie než kratšie. Ak dáme do gélu veľa agarózy, krátke fragmenty sa budú oddeľovať pekne, ale dlhšie kúsky nebudú môcť gélom skoro vôbec putovať, tak zostanú niekde na začiatku gélu blízko pri sebe. Menej agarózy v géle dovolí aj dlhším fragmentom, aby sa lepšie oddelili. Rozdiely závisia na niekoľkých miligramoch agarózy. Ak sa normálne rozpúšťa napríklad 1 gram agarózy v 100 ml pufru, tak napríklad už pri 2 gramoch by sa fragmenty o dĺžke viac než 5000 nukleotidov (písmen ATCG) skoro vôbec nepohli a nedali opticky rozlíšiť.
Najdôležitejšia vec je naviazať na našu DNA špeciálne farbivo pre DNA+RNA, ktoré svieti pod UV lampou. V niektorých laboratóriách pridajú trochu tohoto farbiva rovno do gélu a v iných laboratóriách zvyknú ho zamiešať do loading buffru, a tak priamo zmiešať s DNA. Keď elektroforéza skončí a DNA poputuje na koniec gélu, tak gél dáme do fotografického zariadenia a ožiarime UV svetlom a pozrieme sa, akú dĺžku a približnú koncentráciu má naša DNA. To odhadneme pomocou kontrolného "rebríka", čo je kontrolná DNA nakrájaná na kúsočky o známej dĺžke a koncentrácií. Keď ju porovnáme s našou vzorkou, tak máme hneď jasno, ako naša DNA vyzerá.
Keď som sa moju "DNA" z banánu pokúsila naniesť do dierky v tomto géle, celá vzorka mi vytiekla do vaničky, pretože pravdepodobne asi ešte obsahovala zbytky alkoholu, a ten nedovolil DNA usadiť sa na dne dierky v géle, aj napriek tomu, že bola zmiešaná s loading buffrom. Ach! Zúrila som.
Odhodlala som sa zopakovať izoláciu DNA v kuchyni, tentokrát z jahody. Teraz už som bola trochu nahnevaná, snažila sa veľmi veľa mixovať a možno som na jednu maličkú jahôdku pridala až príliš veľa saponátu a dokonca pridala aj nejaký gél na pranie. Môj cieľ bol bunky čo najdrastickejšie rozložiť, aby som mohla vylúčiť, že dôvodom potenciálneho neúspechu určite nebude nedostatočné rozloženie bunkových stien a jadra. Červená jahôdka sa zmenila na zelenú džabanicu. Pridala som k nej alkohol a čakala plávajúcu bielu medúzu. Zase sa mi to nejako nepozdávalo, ale nabrala som to na vatovú tyčinku a umiestnila do novej prázdnej tuby. Na druhý deň som nechala odparovať alkohol pri zvýšenej teplote. Keď už sa celý odparil, rozpustila som usadeninu vo vode a naniesla na gél.Tu môžete vidieť výsledok. Priznám sa, že nikdy som nevidela nič podobné. Očakávala som svietiaci objekt na začiatku rebríka, niekde vo výške nad najvyššou paličkou rebríka - viac než 10000 nukleotidov (bp). Objavila sa mi podivná banda na konci
rebríka (100-200 bp). Čože to je? Zdegradovaná DNA? Alebo RNA? Tu musím zdôrazniť, že všade na internete sa píše o extrakcii DNA vo vlastnej kuchyni, ale zabúda sa na to, že RNA sa touto metódou vyextrahuje tiež a je jej v bunke poriadne veľa. Aj ona sa uvoľní pri týchto po rozložení bunkových štruktúr a nerozpúšťa sa v alkohole. Na druhej strane je ale oveľa menej stabilnejšia ako DNA. Keď ju už máme vyizolovanú, môže ju zničiť za krátky čas aj izbová teplota, a dokonca aj enzým RNÁza, ktorý sa nachádza skoro všade, dokonca aj na našich rukách. A preto je veľmi dôležité mať pri práci v laboratóriu rukavice. Na fotke tohoto môjho gélu ma však prekvapil druhý jasnejšie svietiaci objekt, ktorý sa nachádza na obrázku trochu vyššie. Ten tiež žiaril pod UV svetlom, takže sa dal odfotiť, ale v skutočnosti nebol naviazaný na to DNA+RNA farbivo, čo som spoznala podľa toho, že svietil inou farbou. Nikdy som nič také nevidela, možno to bol nejaký zbytok pracieho gélu, ktorý bol tiež negatívne nabitý, a preto sa posúval v elektrickom poli ako keby to bola DNA. Ak si to tu číta nejaký chemik či biológ, napíšte mi do diskusie vaše názory, čo to asi mohlo byť.
Takéto zbytky sa pri laboratórnej extrakcii nemôžu objaviť, lebo po pridaní alkoholu sa DNA prečistí buď špeciálnymi filtrami alebo chemickými látkami (fenol-chloroform). Nakoniec dostaneme len čistú DNA/RNA rozpustenú vo vode. Všeobecne je laboratórna extrakcia oveľa čistejšia a nepoužívajú sa pri nej, samozrejme, žiadne saponáty na nádoby ani gély na pranie, ale prísne sterilizované chemikálie.
Priznám sa, že extrakcia DNA v mojej kuchyni ma trochu unavila a nebudem s ňou už strácať viac času. V laboratóriu ju už mám pekne zoptimalizovanú a vždycky mi pekne vychádza. V kuchyni sa radšej budem venovať pokusom, ako pripraviť domáce knedlíky alebo parené buchty zo španielskych surovín, čo je možno ešte väčšia výzva.
Aj keď som vám nedokázala urobiť fotografiu DNA ako peknej bielej medúzy, dúfam, že vás tento blog inšpiroval skúsiť to v kuchyni napríklad s vašimi deťmi a vzbudiť v nich záujem o prírodu. Ak to na prvý krát nevyjde, nezúfajte. V laboratóriu trvá niekedy celé týždne, mesiace či dokonca niekedy aj roky zoptimalizovať nejaký laboratórny protokol, aby vychádzal perfektne. Najhoršou súčasťou života v laboratóriu sú večné neúspechy, ktoré sú však zároveň skúsenosťami a posúvajú nás vpred ku konečnému výsledku. Bohužial to niekedy ale trvá veľmi dlho. Ale extrakcia DNA je jedna z tých najjednoduchších vecí, ktoré sa v laboratóriu molekulárnej genetiky robia. Na druhej strane je ale extrémne dôležité pri extrakcii DNA stanoviť presne, aké množstvá chemikálií a enzýmov sa pridajú a pri akej teplote a na aký čas ich necháme pôsobiť. Stačí malá zmena, menej miešať či nechať pôsobiť kratší čas, či pridať o pár mikrolitrov menej nejakého enzýmu a zmeny môžu by katastrofálne. Laboratórne protokoly nie sú žiadne Babicove recepty. Napríklad v našich pokusoch, kde sledujeme zloženie druhov baktérií vo výkaloch, izolujeme DNA z mnohých rôznych druhov baktérií naraz, ktoré sa odlišujú hrúbkovej bunkovej steny, takže aj malá zmena protokolu môže znamenať, že sa z nejakého druhu baktérie nevyizoluje DNA tak dobre ako z iného, a to bude mať za následok chybný výsledok, že je tam tej baktérie menej. Pritom za jej malý výskyt vo výsledku môže len chybná extrakcia DNA.
