Všetko začína tým, že z organizmu, ktorý chceme skúmať, musíme dostať jeho DNA. Musíme na jeho bunky nechať pôsobiť rôzne chemické látky, aby sa z jeho bunkového jadra DNA uvoľnila a očistila. Nemusí to byť práve DNA z bunkového jadra - ak nás zaujíma DNA z iných bunkových štruktúr (mitochondrií, plasmidov, chloroplastov), tak musíme laboratórny protokol pozmeniť, aby sme do skúmavky dostali len taký typ DNA, ktorá nás zaujíma.
Začínať s DNA tiež ale nie je povinné. Ak nás zaujímajú len gény, ktoré sú v danom momente života bunky aktívne, tak môžeme náš chemický protokol pozmeniť tak, aby sme dostali iba RNA (a originálnu DNA vyhodíme). RNA kontroluje expresiu génov. To znamená, že pracuje ako prepisovateľ toho, čo je v našom DNA genetickom kóde, ale odpíše len to, čo je v danom momente potrebné. Podľa toho bunka vie, aké proteiny má vyrobiť. Preto napríklad aj napriek tomu, že máme po celý život ten istý genetický kód (DNA), vyzeráme v starobe inak ako v mladosti. A tiež aj preto sú naše bunky kože iné ako naše bunky oka, aj keď všetky bunky nášho tela majú tú istú DNA. Teda na to, aby sme zistili, aká časť DNA je aktívna, vyizolujeme z bunky len RNA a tú potom pomocou ďalšej trochu komplikovanej chemickej reakcie môžeme premeniť umelo v skumavke na DNA. Táto v skumavke vytvorená DNA bude obsahovať iba gény, ktoré boli v danom momente aktívne (volá sa to už cDNA).
Takže keď už máme DNA pripravenú pekne v skumavke, tak nasleduje rozhodnutie, či budeme chcieť vedieť jej celú sekvenciu, alebo nás zaujíma len 1 gén v rôznych bunkách. Priblížim vám moju prácu s baktériami z výkalov. V skúmavke mám veľa baktérií, vyizolujem z nich DNA a stojím pred rozhodnutím, či budem chcieť identifikovať presne, aké druhy baktérií a približne v akom percentuálnom zastúpení sa v mojej skumavke nachádzajú alebo či budem chcieť spoznať ich celý genóm - teda metagenóm (viac o metagnóme a DNA v mojom predchádzajúcom blogu).
Ak budem chcieť presne identifikovať baktérie v mojej skumavke, podrobím ich DNA jednej chemickej reakcii, ktorá sa volá PCR (polymerase chain reaction). Zistilo sa, že baktérie majú jeden veľmi zakonzervovaný gén, ktorý nám slúži podobne ako kľúč na určovanie húb alebo rastlín. Podľa jeho sekvencie, teda poradia nukleotidov - písmen ATCG - dokážeme určiť, do akého druhu, rodu či familie baktéria patrí. Reakcia PCR nám pomôže z veľkého genómu baktérie, ktorý má asi jeden až päť miliónov písmen, namnožiť len tento identifikačný gén (ktorý má len cca 1500 písmen) a zbytok génov sa nenamnoží. Takto sa skoro úplne zbavíme zbytku genómu baktérie, ktorý by nám s presnou identifikáciou nepomohol. PCR sa, samozrejme, používa aj na akékoľvek iné gény, v bežnom živote nám pomáha napríklad identifikovať otcovstvo alebo vrodené chyby. Gén, ktorý chceme namnožiť si vyberieme pomocou takzvaných primerov. Primer je niekoľko nukleotidov za sebou, ktoré nám vyrobia na objednávku v špeciálnych laboratóriách. My si ich ale musíme navrhnúť sami. Musíme poznať približne sekvenciu génu, ktorý chceme pomocou našej PCR namnožiť, a podľa toho navhrneme sekvenciu dvojice primerov - jeden na začiatku a druhý na konci génu. Reakcia PCR nám odhalí sekvenciu, ktorá sa skrývala medzi jedným a druhým primerom. Na DNA budeme pôsobiť rôznymi teplotami, a tak docielime, že sa tieto primery prilepia na zhodné (komplementárne) úseky DNA. Komplementárne sú A-T a C-G. Takže tam, kde je na pôvodnej sekvencii A, prilepí sa T, tam, kde je pôvodne G, prilepí sa C. A o dotvorenie sekvencie medzi nimi sa postará jeden enzým - polymeráza, ktorá dokáže prilepovať voľné písmenká v reakcii podľa pôvodnej sekvencie, a tak v skumavke umelo vytvoriť mnoho kópií pôvodnej DNA. Ak tieto zmeny teplôt zopakujeme cca 30 krát, úsek medzi dvoma primermi sa namnoží niekoľko miliónov krát, zatiaľčo celistvá originálna DNA zostane len jedna.
Každý sekvenátor má svoje obmedzenia. Ideálne by bolo, keby sme do sekvenátora mohli dať celú DNA o svojej dĺžke aj niekoľko miliónov písmen. Bohužiaľ, v dnešnej dobe sekvenátory dokážu vyprodukovať sekvencie o dĺžke tak maximálne 1000 písmen. Preto, ak sa rozhodneme pre sekvenovanie celého genómu nejakého organizmu, musíme jeho DNA nakrájať na kúsky. Existuje niekoľko rôznych prístrojov, ktoré strihajú DNA pomocou ultrazvuku, hydrodynamiky alebo tlaku plynov. No a najhoršie je, že ak genóm osekvenujeme takto po kúskoch, je potom problém poskladať ho v počítači naspäť. V prípade sekvenovania jediného génu, napríklad toho na identifikáciu baktérií, nemusíme nič skladať, ak produkt našej PCR reakcie má menej písmen než je limit sekvenátoru.
Takže to zhrniem: DNA vyizolujeme z bunky. Môžeme ju buď rovno nakrájať na kúsky (ak nás zaujíma celý genóm) alebo z nej vybrať a namnožiť jeden gén pomocou PCR (v tom prípade už nemusíme DNA krájať).
A teraz vám vysvetlím, aký je rozdiel medzi starým sekvenátorom, ktorý využíval takzvanú Sangerovu metódu (napr. DNA ABI 3730 od Applied Biosystems) a najmodernejšími sekvenátormi (v mojom prípade 454 GS FLX+ od Roche), kde sa už hovorí o high throughput sequencing, teda na tých nových sa dá sekvenovať oveľa viac a oveľa rýchlejšie než predtým.
Pri tejto staršej metóde sa DNA už o dĺžke nejakých cca 500 nukleotidov musela zlepiť lepiacimi enzýmami s takzvaným plasmidom (kruhovitá DNA, o tom tiež v mojom minulom blogu). Jeden plasmid sa zlepí s jedným kúskom DNA. A táto naša DNA sa vo forme krúžku vniesla pomocou elektrošoku do baktérie E.coli, ktorú v laboratóriu dokážeme veľmi jednoducho kultivovať. Baktéria, ktorá elektrošokom dostala do seba plasmid s naším kúskom DNA, získala zároveň aj resistenciu na antibiotikum, v ktorom baktérie bez plasmidu neprežijú. Môže nastať ale jedna komplikácia, že kruhovitý plasmid sa odmiene prilepiť k našej DNA a zalepí sa späť sám k sebe. V tom prípade by baktéria prežila v antibiotiku, ale neniesla by našu DNA. Na to ale vedci už vymysleli trik. Do kultivačného média sa pridá špeciálna chemická látka a ak baktéria v sebe nosí plasmid bez našej DNA, tak jej kolónia sa sfarbí na modro. Len tie správne baktérie s plasmidom a s našou DNA budú mať normálnu bielu farbu. To všetko vďaka špeciálnemu génu v plasmide, ktorý sa rozdelí na polovicu, ak sa doňho vlepí naša DNA. Ak sa tam žiadna DNA neprilepí a plasmid sa sám znovu zatvorí, tak sa spojí aj tento gén a v špeciálnom kultivačnom médiu sa takáto kolónia sfarbí na modro. Niektoré firmy si už patentovali špeciálne plasmidy, ktoré majú namiesto farbiaceho génu smrtiaci gén. Baktéria, ktorá má v sebe spojnený plasmid bez našej DNA, jednoducho neprežije. Baktéria sa pekne množí a tak sa množí aj naša DNA. Tento proces sa volá klonovanie DNA.
Potom nasleduje strašná mravenčia práca. Všetky kolónie na kultivačnej miske, ktoré majú našu DNA sa musia jedna po druhej vypichať a zoradiť do 96 jamkových dostičiek. Predstavte si, že chcete osekvenovať genóm jednej obyčajnej baktérie, ktorá má dĺžku napríklad 3 000 000 písmen. Je nasekaná na kúsky o dĺžke 500 písmen. To je 6000 kolónií. Musíte to ale vynásobiť ešte aspoň 10-krát, pretože potrebujeme celý genóm niekoľkokrát pokryť, aby sa kúsky DNA prekrývali a dali sa potom v počítači pospájať. A tiež treba aj počítať so stratami pri klonovaní, takže to treba vynásobiť ešte vyšším číslom. Takže stovky 96 jamkových dostičiek je treba na to, aby sa osekvenoval jeden genóm baktérie. S každou dostičkou treba urobiť ešte jednu PCR, ktorá z bakteriálnej kolónie namnoží len našu DNA, to je to, čo nás zaujíma. V tomto prípade ako primery použijeme dva úseky plasmidu, aby sa nám odhalila sekvencia DNA, ktorá sa vlepila do tohoto plasmidu. A potom ešte nasleduje ešte jedna PCR reakcia, ktorá pripraví našu DNA rovno do toho staršieho sekvenátora. Sekvenátor číta sekvencie v každej jamke týchto 96-jamkových dostičiek, takže o nejakej veľkej výkonnosti sa nedá hovoriť.
Naopak v prípade nových sekvenátorov (next generation sequencing) už žiadne baktérie a žiadne klonovanie nie je potrebné. Ku DNA nakrájanej na kúsky sa z obidvoch strán prilepia takzvané adaptory, čo sú tiež krátke sekvencie nukleotidov (niečo podobé ako primery). Klonovanie do baktérií E.coli, ktoré slúžilo na namnoženie našich jedinečných úsekov DNA sa nahradilo namnožením DNA na mikroskopických guličkách v kvapkách oleja. Vedci vymysleli metódu, ako už spomínanú reakciu PCR uskutočniť v jednej maličkej kvapke oleja. Docielilo sa, že v každej kvapke bude len jedna gulička a jeden kúsok DNA o tej spomínanej dĺžke cca 500 písmen, ktorý sa bude v tomto mikroreaktore kopírovať veľakrát, aby sa dosiahol dostatočný signál, ktorý prístroj - sekvenátor dokáže prečítať. A v prípade týchto moderných prístrojov už nehovoríme o žiadnych stovkách 96 jamkových dostičiek. Tu sa všetko dáva na jednu malú dostičku so špeciálnym povrchom s mikroskopickými jamkami, kam sa do každej jamky vojde len jedna gulička, takže vlastne len jedna namnožená sekvencia. Tých jamiek može byť na jednej došticke až 1 milión! A guličky nemusíme do jamiek vkladať jednu po druhej ručne, všetko sa to urobí naraz automaticky pomocou odstredivej sily.
No a ako dokáže prístroj prečítať to poradie písmen - teda sekvenciu nukleotidov? V každej jamke zase prebieha ďalšia reakcia PCR. Polymeráza zase prikladá k originálnej sekvencii nukleotidy a skúša, ktoré z týchto 4 písmen A, C, T, G sa k originálu komplementárne hodí. Ak sa nájde to správne písmenko, vyšle sa svetelný signál, ktorý zachytí kamera a zapíše si ho. Sekvenátor dokáže prečítať týchto milión sekvencií v priebehu 10-24 hodín.
Nakoniec dostaneme obrovské množstvo sekvencií a stojíme pred veľkou úlohou pospájať ich v počítači do jedného genómu alebo identifikovať, aké baktérie sme v našej skumavke pôvodne mali. Bioinformatika je vlastne samostatný vedný odbor, takže o tom nabudúce.
