Značkovanie vírusmi

V mnohých starších blogoch som už písala o tom, ako sa nám vedcom prakticky každý deň darí objavovať nové baktérie – buď sú to úplne nové druhy baktérií, o ktorých ešte nikto nikdy nepočul, alebo sú to nové kmene už dobre známych druhov, ktoré obsahujú nejaké nové kúsky DNA, ktoré im dodávajú nejaké zvláštne schopnosti. Tieto objavy robíme tak, že z akejkoľvek vzorky pozbieranej z akéhokoľvek miesta či organizmu rovno vyextrahujeme DNA a rozlúštime sekvencie DNA pomocou našich najmodernejších DNA sekvenátorov. V tejto zmesi DNA máme kúsky z každej baktérie, ktorá sa vo vzorke nachádzala a nemusíme sa starať o to, či sa daná baktéria dá pestovať v laboratóriu alebo nie. Práve pestovanie baktérií v laboratóriu bolo v minulosti pre vedcov veľmi obmedzujúce. Až vďaka sekvenovaniu DNA sa zistilo, že exituje strašne veľa druhov baktérií, o ktorých nikto netušil, pretože ich dovtedy nikto nedokázal pestovať v laboratóriu.

DNA sekvenátory produkujú veľké množstvo sekvencií a vedci si často všímajú iba tie veci, ktorým rozumejú. Vo výsledkoch z environmentálnych vzoriek sa často objavovali neznáme sekvencie, ale kedže nikto nebol schopný ich vysvetliť, tak sa iba “odkladali na neskôr”. Potom sa vedci z rôznych výskumných pracovísk po celom svete začali radiť, čo s týmito odloženými sekvenciami urobiť. A spomenuli si na bakteriofágy. Bakteriofágy (skrátene fágy) sú vírusy, ktoré napádajú baktérie. V tej dobe sa vedelo len o niekoľkých stovkách bakteriofágov, ktoré sa dali pestovať v laboratóriu. Ale keď potom vedci vyvinuli algoritmy na hľadanie bakteriofágov v “odložených sekvenciách”, zrazu sa im podarilo objaviť niekoľko stoviek tisíc druhov bakteriofágov! A toto číslo neustále rastie.

Tu je ako príklad článok publikovaný v Nature v roku 2016 – autori sú moji kolegovia z Joint Genome Institute, kde pracujem teraz už aj ja. V roku 2016 hlásili 125 000 fágov, dneska ich majú 730 000, ale to sú iba tie, ktoré majú v teraz dostupných sekvenciách. V skutočnosti je ich oveľa viac!

No a v momente, keď vedci objavili túto ohromnú diverzitu bakteriofágov nastal problém – zrazu ich bolo potrebné pospájať s ich hostiteľskými baktériami, aby sme rozumeli, aká je ich funkcia v danom prostredí. Klasická laboratórna metóda na hľadanie spojitosti fágov a baktérii prebieha tak, že sa k bakteriálnym bunkám rastúcim na Petriho miske pridajú vírusy z environmentálnej vzorky a ak prebehne infekcia, tak sa na povrchu agaru, v ktorom rastú baktérie, objavia priehľadné dierky, pretože sa v nich začal rozmnožovať bakteriofág, ktorý bakteriálne bunky po infekcii roztrhal. Bohužiaľ sa táto metóda dá aplikovať iba na baktérie, ktoré sa dajú pestovať v laboratóriu a je pomalá v porovnaní v neustále rastúcim množstvom novoosekvenovaných fágov z environmentálnych vzoriek. Existujú výpočtové metódy na spájanie baktérií s fágami, ale tie pri veľkej časti týchto novoobjavených fágov zlyhali.

Potom môjmu bývalému austrálskemu šéfovi Philovi Hugenholtzovi napadla zaujímavá myšlienka. Prezradím vám, ako to celé začalo, ako mi to vyrozprával sám Phil. Na jednej konferencii stretol svojho známeho Matta Sullivana, ktorý pôsobí v USA, a dali sa do reči o tom, aké je ťažké pomocou prietokového cytometra triediť vírusy, lebo sú veľmi malé. Pretokový cytometer som už spomínala v mojich starších blogoch – je to prístroj, ktorý dokáže za sekundu pretriediť tisíce baktérií podľa veľkosti a farby. No a Philovi napadlo, že triedenie vírusov by bolo oveľa jednoduchšie, keby sme ich spojili s baktériami, ktoré napádajú. A tak vznikol projekt “viral tagging” (značkovanie vírusmi), ktorý nakoniec zrealizovala Mattova vtedajšia doktorandka Li Deng a v roku 2014 z toho vzišiel článok v Nature. Li Deng teraz pôsobí v Nemecku a má na výskum bakteriofágov ERC grant.

Viral tagging umožnuje “jedným šupom” objaviť naraz mnoho druhov fágov schopných napadnúť vybraný druh baktérie. Pri metóde, ktorú vyvinula Li, bolo ešte ale stále potrebné pestovať hostiteľskú baktériu. Ale aspoň to bol spôsob, ktorý vedcom ušetril naozaj veľmi veľa mesiacov či rokov laboratórnej práce s Petriho miskami.

Phil chcel túto metódu posunúť do ďalšieho levelu – zmiešať všetky fágy z jednej environmentálnej vzorky so všetkými baktériami z tej istej alebo inej environmentálnej vzorky, aby sa už ani hostiteľská baktéria nemusela pestovať. Na stránky University of Queensland, ku ktorej patrí jeho výskumné stredisko, dal “job offer” na túto tému. Ja som v tej dobe práve končila doktorát v Španielsku a ako to už býva zvykom, hlaďala som si post-dok pozíciu v zahraničí. No a po pracovnom pohovore cez Skype som sa dostala do Austrálie, kde na mňa čakala ťažká úloha – Phil mi oznámil, že nikto okrem Li nebol doteraz schopný “viral tagging” zopakovať. Takže moja úloha bola, aby táto metóda začala fungovať v austrálskom laboratóriu. K tomu som ju mala zdokonaliť tak, aby fungovala aj pre baktérie, ktoré sa nedajú kultivovať.

A to teda vôbec nebolo jednoduché! Možno sa z mojich fotiek na sociálnych sietiach mohlo zdať, že som stále iba na pláži či v pralese, v skutočnosti som tvrdo drela v labáku. Ľudia si pri pojme Austrália vybavia hlavne nejaké hady, pavúky, žraloky, krokodíly, samozrejme aj koaly či klokany… Ale málokto vie, že sa v Austrálii robí veda sa svetovej úrovni. Phil je svetoznámy bakteriálny fylogenetik, o jeho objavoch napíšem určite ešte nejaký blog. Predtým pracoval veľa rokov práve na už spomínanom Joint Genome Institute v Kalifonii. Potom sa vrátil do Austrálie, kde mu na univerzite postavili vlastné výskumné centrum. Philova výskumná skupina produkuje každý rok niekoľko článkov v Nature alebo Science, ale to, že sa človek dostane do jeho laboratória neznamená automatický úspech. Počas troch rokov v Austrálii som mala aj kolegov, ktorým jednoducho nebola predĺžená zmluva, pretože neprodukovali výsledky tak, ako sa od nich očakávalo. Ja som brala svoju úlohu dosť zodpovedne, lebo pre mňa bolo moje pôsobenie v Philovej skupine jedinečnou životnou šancou publikovať v Nature. Aby tento blog nebol veľmi dlhý, vysvetlenie podrobností metódy nechám do budúceho blogu a teraz prejdem rovno k výsledkom.

Z prvej fázy “viral tagging” pre nekultivovateľné baktérie vznikla akási sieť, ktorá predstavuje všetky nájdené spojenia medzi fágmi a baktérami v tomto experimente. V tejto prvej fáze som mala k dispozícii vzorky stolice od 11 dobrovoľníkov, kde sa zmiešali baktérie zo stolice jedného dobrovoľníka s fágmi z toho istého dobrovoľníka. Zaujímavé na tejto sieti je, že aj keď sa dá mnoho baktérii z ľudského tráviaceho traktu ľahšie či ťažšie pestovať v laboratóriu, objavili sme fágy, o ktorých nikto netušil. Fágy boli väčšinou verné jednému druhu baktérii (napríklad len Ruminococcus faecis), ale našli sme aj jedného fága, ktorý bol schopný napadnúť niekoľko rôznych rodov baktérií (Dorea, Anaerostipes a Ruminococcus). To je veľmi dôležitý poznatok, pretože vedci, ktorý testujú špecificitu fágov v laboratóriu na Petriho miskách majú k dispozícií iba niekoľko bakteriálnych druhov, či len kmeňov (izolátov) z jedného druhu, tak môžu získať mylné výsledky, že ich fág je špecifický, ale pritom nevyskúšali všetky baktérie z daného prostedia, lebo ich proste nevedia pestovať. Tieto spojenia nám umožnili zistiť niečo aj o správaní fágov v ekosystéme tráviaceho traktu. Človek by si možno predstavoval, že sú to automatickí zabijaci, lebo robia na Petriho miskách diery, ale v skutočnosti fágy v ľudskom tele nie sú až tak agresívne. Je to vlastne aj logické, pretože keby sme mali v tráviacom trakte zabijacké fágy, ktoré by každú chvíľu vraždili nejaké baktérie, tak by sa zloženie nášho mikrobiómu menilo strašne rýchlo, a to by naše ostatné orgány proste nezvládli.

Ďalším krokom v tomto “viral tagging” experimente bolo vyskúšať, ako budú reagovať baktérie z jedného dobrovoľníka s fágami z iného dobrovoľníka. Bola to akási simulácia transplantácie mikrobiómu, ale v skúmavke. Pri transplantácii mikrobiómu pacient s problémami tráviaceho traktu prijme kapsulu s mikrobiómom od zdravého človeka. Táto metóda sa používa v experimentálnej medicíne, ale nevie sa ešte presne, čo ovplyvňuje jej fungovanie. V jednej nedávnej štúdii sa zistilo, že kapsula, ktorá obsahuje prefiltrovanú stolicu, kde sú iba fágy a metabolity baktérií zo stolice, ale nie sú v nej žiadne baktérie, má rovnaký pozitívny účinok ako kapsula obsahujúca aj baktérie. V mojom experimente v skúmavke sme si pri kombináciách fágov a baktérií medzi rôznymi dobrovoľníkmi všimli, že fágy by mali schopnosť vyhľadať v “novom tele” tie druhy baktérií, ktoré napádali predtým v tele pôvodného darcu. Znamená to, že fágy sa väčšinou nešpecializujú len na jeden kmeň (izolát) svojho hostiteľského bakteriálneho druhu, ale na viac kmeňov. Takýto masívny skríning potenciálnych hostiteľov prináša veľa prekvapení pre vedcov, ktorí na určovanie spojitosti baktérii a fágov používali iba kultivačné metódy na Petriho miskách.

Otázka špecificity fágov je veľmi dôležitá pri bioinžinierskom vývoji fágov, ktoré by mohli liečiť závažné bakteriálne infekcie, a tak nahradiť antibiotiká, na ktoré si baktérie v posledných rokoch veľmi rýchlo vytvárajú rezistencie. Je to úžasná myšlienka, ale nemali by sme sa unáhliť. Obávam sa, že sa špecificita týchto fágov bude zisťovať zase len testovaním niekoľkých bakteriálnych izolátov v laboratóriu. Na to, aby bolo použite fágov naozaj bezpečné, potrebujeme preskúmať daného pacienta úplne dokonale - pretože zatiaľčo srdce či pľúca sú rovnaké u každého, mikrobióm ma každý človek inakší. Ľudské telo obsahuje miliardy rôznych mikróbov a mnohé z nich sú neznáme. A u tých, čo známe sú, nevieme, ktoré zo svojich potenciálnych funkcií v danom momente používajú. Baktérie sa množia neuveriteľnou rýchlosťou, ich počty a pomer druhov sa mení počas života a občas si aj menia svoj genetický obsah. Aj keď vo všeobecnosti obsahuje tráviaci trakt každého človeka zhruba rovnaké druhy baktérií, sú to iné bakteriálne kmeňe (izoláty), čo môže znamenať veľké rozdiely. O ľudskom mikrobióme ako celku sme sa v posledných rokoch naučili veľmi veľa nových poznatkov, ale nie je jasné, do akej miery treba preskúmať individuálny mikrobióm každého pacienta, aby sme si boli istí, že liečba fágom bude úspešná a nebude mať žiadne negatívne následky na ekosystém v tele. Pri použití fágov teda stojíme pri ťažkých ekologických rovniciach a možno moja metóda “viral tagging” by mohla pomôcť vyriešiť tento problém.