_________________________
Článok vznikol na základe mojich poznámok z niekoľkých prednášok o medicínskej chémii, ktoré v r. 2008 na Prírodovedeckej fakulte UK predniesli významní predstavitelia tohto odboru, Dr. Richard Lee (Angličan pôsobiaci v USA) a prof. Chris Abell (z University of Cambridge). Neobsahuje teda "horúce novinky", ale pokiaľ niekoho zaujíma, ako napríklad vedci vlastne "vymýšľajú" nové antibiotiká, ako tieto na baktérie pôsobia a ako vzniká rezistencia, mohol by mu poskytnúť istú predstavu.
_________________________
Baktériu možno odstaviť mnohými spôsobmi
Súčasné antimikrobiálne lieky zasahujú bakteriálne bunky zväčša na úrovni niektorého z týchto štyroch procesov: vznik bunkovej steny, bez ktorej sa baktéria nemôže rozdeliť (penicilíny, cefalosporíny), syntéza proteínov (makrolidové antibiotiká, tetracyklíny, chloramfenikol), replikácia DNA (chinolóny), tvorba RNA (rifampicín). Vhodným a využívaným cieľom sú tiež enzýmy podieľajúce sa na syntéze esenciálnych metabolitov, napríklad kyseliny tetrahydrofolovej (redukovanej formy kyseliny známejšej pod názvom listová) či koenzýmu A ("pomocníka" mnohých enzýmov).
Podstatné je, aby sa enzým inhibovaný antibiotikom dostatočne odlišoval od enzýmu s podobnou/rovnakou funkciou u človeka. Ideálne je, ak pôsobí dokonca v procese, ktorý prebieha v bakteriálnych, ale nie v ľudských bunkách. Medzi ne patrí aj syntéza bunkovej steny či kyseliny tetrahydrofolovej.
Inhibítory enzýmov sú molekuly, ktoré znižujú ich aktivitu (resp. ich celkom vyradia) svojou väzbou na ne. Často to býva na miesto, kam sa viaže substrát (premieňaná látka, reaktant), ale mnohé sa viažu na inú esenciálnu oblasť enzýmu. Táto väzba môže byť reverzibilná (dočasná) alebo ireverzibilná (definitívna). Početné liečivá pôsobia ako inhibítory enzýmov. Zablokovaním esenciálneho enzýmu zastavujú rast či spôsobujú smrť patogénu, iné zase zásahom do ľudských buniek zabraňujú nežiaducemu procesu, prípadne napravujú metabolickú nerovnováhu.
Obr.: Schéma jedného z typov reakcií katalyzovaných enzýmom
a účinku jedného z typov inhibítorov na ňu.
Zjednodušenie náčrtu nespočíva len v zobrazení enzýmu
(ktorého 3D štruktúra je obvykle veľmi zložitá) a ostatných látok ako jednoduchých geometrických útvarov, ale napr. tiež v prezentácii väzieb na enzým
ako "zapadnutia do jamky". Bližšie realite je často používané prirovnanie k navlečeniu ruky do rukavice, ktorá sa, najmä pokrčená, svojím 3D tvarom tiež na pohľad ruke dostatočne nepodobá, ale prispôsobí sa jej v prípade potreby.
Cielený dizajn umožnený modernými počítačovými metódami zefektívnil vývoj liečiv
Vývoj antibiotík, tak ako všetkých ostatných liekov, vyžaduje medziodborový prístup. Kombinuje organickú chémiu s biochémiou, výpočtovou (teoretickou) chémiou, farmakológiou, molekulárnou biológiou, štatistikou a fyzikálnou chémiou. Zahŕňa (1.) identifikáciu alebo dizajn potenciálne využiteľných molekúl, (2.) hľadanie nových postupov syntézy, (3.) nových terapeutických cieľov v bunkách i (4.) nových metód umožňujúcich testovanie účinkov obrovskej škály látok. Dôležité je aj (5.) štúdium už existujúcich liečiv; jednak odhaľovanie mechanizmu ich účinku, biologických vlastností, vzťahu ich štruktúry a aktivity, jednak testovanie ich prípadného použitia pri liečbe iného ochorenia.
Už v 30-tych rokoch minulého storočia sa začali používať sulfanylamid a jeho deriváty, sulfónamidy, najmä proti streptokokovým a stafylokokovým infekciám. V 40-tych rokoch boli v tieni penicilínu, avšak neskôr, s rozšírením kmeňov rezistentných voči penicilínu a jeho derivátom, záujem o ne opäť vzrástol. Až koncom 60-tych rokov, keď bola prvýkrát z baktérií purifikovaná dihydropteroátsyntáza (DHPS), bol tento enzým definitívne potvrdený ako cieľ, na ktorý sulfónamidy pôsobia. Inhibítory DHPS sa osvedčili v boji proti rôznym baktériám, ale tiež eukaryotickým patogénom - hubám a prvokom.
Dnes je už známa trojrozmerná štruktúra DHPS z niekoľkých patogénnych baktérií vrátene Mycobacterium tuberculosis, vďaka čomu bolo možné pristúpiť k dizajnu nových, účinnejších chemoterapeutík. (Tuberkulóza, mimochodom, ani zďaleka nie je problémom minulosti. Ročne si vyžiada asi tri milióny obetí a nakazená je ňou zhruba tretina ľudstva.) Práve priestorová štruktúra proteínu (enzýmu), na ktorý sa viaže inhibítor, je totiž východiskom pre cielený dizajn liečiv (tzv. structure-based drug design). Či už ide o navrhovanie nových látok, alebo chemických modifikácií už používaných liečiv, toto počítačové modelovanie má napriek niekoľkým obmedzeniam značné výhody. V súčasnosti je totiž v databázach k dispozícii obrovské množstvo 3D štruktúr tzv. malých molekúl (small molecules; ide o organické zlúčeniny a "malé" sú v porovnaní s biomakromolekulami, napr. proteínmi). Z nich možno odfiltrovať všetky s neželanými vlastnosťami a tie zvyšné jednoducho a lacno "virtuálne testovať" - bez nutnosti ich laboratórnej prípravy. Molekuly, ktoré podľa teoretických modelov svojím tvarom a fyzikálno-chemickými vlastnosťami vhodne "zapadajú" do aktívneho miesta cieľového enzýmu, a teda s vysokou pravdepodobnosťou budú schopné sa naň naviazať a tým ho inhibovať, sú potom syntetizované a testované in vitro, čiže "v skúmavke", na izolovanom cieľovom enzýme. Ak sa potvrdí predpokladaný inhibičný účinok dostatočne nízkej koncentrácie látky na enzým, možno pristúpiť k testom in vivo, teda priamo na modelových organizmoch (najčastejšie myšiach či potkanoch).
V prípade DHPS bolo z trojrozmernej štruktúry zrejmé, že sulfónamidy sa viažu na také miesto na jej povrchu, ktoré môže podliehať spontánnym mutáciám bez dopadu na jej enzýmovú funkciu. Mutácie v tejto oblasti však môžu viesť k takej zmene štruktúry, ktorá znemožní naviazanie sulfónamidu, čo v praxi znamená vznik rezistencie bunky voči tomuto inhibítoru. Štruktúra DHPS však zároveň vypovedá o tom, že miesto, na ktoré sa viaže druhý substrát reakcie, pterínpyrofosfát (PP), by po narušení mutáciou stratilo svoju funkciu. Bunky s takouto mutáciou by v dôsledku znefunkčnenia DHPS, a teda nedostatku kyseliny tetrahydrofolovej, zahynuli. V populácii sa preto vždy budú vyskytovať iba baktérie s nezmeneným väzbovým miestom pre PP, a tak nehrozí, že inhibítor, ktorý by sa naň viazal, by v dôsledku náhodnej mutácie "stratil svoj cieľ".
Po dôkladnejšom preskúmaní štruktúry DHPS a jej dynamiky vedci teda nadizajnovali, pripravili a testovali molekuly viažuce sa na miesto pre PP, prípadne také, čo predstavovali vhodnú kombináciu sulfónamidu a PP. V druhom zmienenom prípade by mal byť výsledkom účinný inhibítor viažuci sa naraz na obe spomenuté miesta tohto enzýmu. Z piatich miliónov východiskových malých molekúl v prvom kole vybrali päťtisíc, z nich iba sto prešlo ďalším kolom počítačových testov a bolo použitých v testoch in vitro. Tu len jediný z nich bol postačujúco účinný v dostatočne malej koncentrácii.
Baktérie môžu byť rezistentné voči lieku vďaka rôznym obranným trikom
Okrem vyššie načrtnutého mechanizmu, založeného na neschopnosti či zoslabení väzby inhibítora na cieľový proteín, je známych ešte niekoľko ďalších princípov rezistencie. Žiaden však nespočíva v tom, že by sa bunka "cielene prispôsobila" na prítomnosť liečiva, ako by mohol laik intuitívne predpokladať. Rôzna citlivosť patogénov toho istého druhu na liečivá je dôsledkom genetickej, prípadne aj fyziologickej variability ich populácie. (1.) Bunka môže začať využívať alternatívnu metabolickú dráhu, paralelnú tej, ktorá je zasiahnutá inhibítorom; koncový produkt jej teda nechýba. (2.) Prechod účinnej látky do bunky môže výrazne klesnúť v dôsledku zmien v bunkovej stene baktérie, prípadne (3.) môže byť "vypumpovaná" von. (4.) Inhibítor môže byť v bunke enzýmovo inaktivovaný, napríklad beta-laktámové antibiotiká (penicilín, ampicilín, ...) sú štiepené beta-laktamázou. (5.) Cieľový enzým môže byť natoľko nadprodukovaný, že počet molekúl inhibítoru v bunke je nedostatočný na jeho vyradenie.
V prípade, že je za rezistenciu zodpovedný jeden gén (napr. gén kódujúci beta-laktamázu), tento sa môže pomerne ľahko preniesť z rezistentných buniek do senzitívnych, a to nie len v populácii jedného druhu, ale niekedy i medzidruhovo. Patogény je teda potrebné vyhubiť skôr, než stihnú náhodným procesom nadobudnúť rezistenciu - preto je dôležité užívať predpísané dávky antibiotika predpísaný počet dní.
Často to však nie je takto jednoduché. V populácii baktérií v nakazenom jedincovi sa totiž už na začiatku neraz vyskytujú také, ktoré sú prirodzene rezistentné. Zatiaľ čo na začiatku tvoria iba menšinu, keď sú zahubené všetky ich senzitívne "sestry" a príznaky ustúpia, postupným množením vedú až k novému nástupu ochorenia.
Baktérie Mycobacterium tuberculosis sú problematické ešte aj v tom, že časť buniek ostáva v latentnom štádiu, v ktorom nie sú citlivé na lieky. Tieto totiž škodia iba deliacim sa bunkám, "spiace" baktérie však v organizme prečkajú a po ukončení liečby sa môžu "prebudiť", deliť a spôsobiť návrat choroby.
Liečivá látka musí spĺňať množstvo kritérií
Potenciálne liečivo musí byť dostatočne stabilné, teda odolné voči ľudskému metabolizmu natoľko, aby viac než 30 % jeho molekúl nebolo organizmom modifikovaných skôr, než dosiahnu svoj cieľ. Musí byť dostatočne rozpustné vo vode (> 50 mg/l) a nesmie sa viazať nešpecificky na proteíny (< 90 % liečiva), keďže naviazaním na zložky séra by sa inaktivovalo. Zároveň je potrebné, aby dokázalo prenikať tkanivami na miesto účinku, napríklad k ložisku infekcie. Samozrejme nesmie byť v terapeutickej dávke toxické a zasahovať by malo iba cieľ, proti ktorému bolo pripravené.
Molekuly, ktoré sú účinné, ale nespĺňajú niektoré (často mnohé) z týchto kritérií, sú východiskom pre dizajnovanie ďalších "kandidátov". Skúsení organickí chemici vedia odhadnúť, aké modifikácie štruktúry molekuly zmenia jej vlastnosti želaným spôsobom. Vďaka počítačovým programom dnes môžu modelovať štruktúru a testovať inhibičné vlastnosti množstva derivátov súčasne.
Kandidátnych látok cielených proti Mycobacterium tuberculosis pripravili vedci pred pár rokmi niekoľko, avšak, napriek inak sľubným vlastnostiam, v testoch in vivo - v myšom modeli - zlyhala väčšina okrem jedinej. Iba tá sa dostala aj do fázy klinických skúšok.
Okrem načrtnutého prístupu k vývoju inhibítorov existujú aj iné alternatívy. Niektoré sú postavené na metódach "pripomínajúcich sci-fi", dokonca so širokým uplatnením aj mimo farmaceutického výskumu. Napríklad mikrokvapôčkové mikroreaktory umožňujú paralelne testovať obrovské množstvo zlúčenín, génov alebo buniek. Využitie mikrokvapôčiek by sa, pravdaže, nezaobišlo bez ďalších technických noviniek, napríklad nanopipety na manipuláciu s "jednotlivými" molekulami proteínov či DNA. S pracoviskom, kde tieto prístroje vyvinuli a uviedli do praxe, nadviazalo, mimochodom, pred pár rokmi spoluprácu aj niekoľko slovenských vedcov.
